酵母基因組DNA大量提取試劑盒

產品簡介： 
本試劑盒采用可以特異性結合 DNA 的離心吸附柱和*的緩沖液系統，提取酵母基因組 DNA。離心吸附柱中 采用的硅基質材料為本公司*新型材料，能夠高效專一吸附 DNA，可大限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機 化合物。提取的基因組 DNA 片段大，純度高，質量穩定可靠。使用本試劑盒提取的基因組 DNA 可用于各種常規 操作，包括酶切、 PCR、文庫構建、Southern 雜交等實驗。

操作步驟： 
使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。所有離心步驟均為使用臺式離心機在 室溫下離心。 
1、在離心管中收集酵母細胞 20-40ml(不超過 109 ce l1 s)，10000rpm 離心 1min，盡量吸除上清。 
2、酵母細胞壁的破除：向酵母菌體中加入 9ml 山梨醇 Buffer。充分懸浮菌體，加入 600ul 酵母破壁酶和 100ul 巰 基還原劑，充分混勻。30℃處理 1-2h，期間可顛倒離心管混勻數次。 
3、10000rpm 離心 lmin，棄上清，收集沉淀。 
4、向沉淀中加入 5ml 溶液 A，充分懸浮沉淀，向懸浮液中加入 500ul 的 RNase A(10mg/ml)，充分顛倒混勻，室溫 放置 10min。 
5、加入 500ul 的蛋白酶 K(10mg/ml)，充分顛倒混勻。65℃水浴消化 30-60min，消化期間可顛倒離心管混勻數次， 直樣品消化*為止。 
6、加入 5ml 溶液 B，再加入 5ml 無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現絮狀沉淀，不影響 DNA 的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，室溫放置 2min。 
7、10000rpm 離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 
8、向吸附柱中加入 7ml 漂洗液(使用前請先檢查是否己加入無水乙醇)。10000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱 放入收集管中。 
9、向吸附柱中加入 7ml 漂洗液， 10000rpm 離心 l min， 棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 
10、10000rpm 離心 2min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除， 否則漂洗液中的乙醇會影響后續實驗如酶切、PCR 等。 
11、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 1-2ml 經 65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置 5min， 10000rpm 離心 l min。 
12、離心所得洗脫液再加入吸附柱中，10000rpm 離心 2 min，即可得到高質量的基因組 DNA。

注意事項： 
1、樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的 DNA 片段較小且提取量下降。 
2、若試劑盒中的溶液出現沉淀，可在 65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響提取效果。 
3、如果實驗中的離心步驟出現柱子堵塞的情況，可適當延長離心時間。 
4、洗脫緩沖液的體積不少于 1ml，體積過小會影響回收效率；洗脫液的 pH 值對洗脫效率也有影響，若需要 用水做洗脫液應保證其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 將水的 pH 值調此范圍)， pH 值低于 7. 0 會降低洗脫效率。 DNA 產物應保存在-20℃，以防 DNA 降解。 
5、 DNA 濃度及純度檢測：得到的基因組 DNA 片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。 回 收得到的 DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA 應在 OD260處有顯著吸收峰，OD260 值為 1.0 相當于大約 50μg/ml 雙鏈 DNA、40μg/ml 單鏈 DNA。OD260/0D280比值應為 1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗 脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為 pH 值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。

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相關文獻：

《A rapid and efficient one-step site-directed deletion, insertion, and substitution mutagenesis protocol》 作者:Deguang Wu，Xuewu Guo，Jun Lu，Xi Sun，Feng Li，Yefu Chen，Dongguang Xiao 期刊:Analytical Biochemistry 影響因子:2.275 PMID:23256925
《Enhanced freeze tolerance of baker’s yeast by overexpressed trehalose-6-phosphate synthase gene (TPS1) and deleted trehalase genes in frozen dough》 作者:Haigang Tan,Jian Dong,Guanglu Wang,Haiyan Xu,Cuiying Zhang,Dongguang Xiao 期刊:Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 影響因子:2.533 PMID:24951963
《A two-step integration method for seamless gene deletion in baker’s yeast》 作者:Jian Dong，Guanglu Wang，Cuiying Zhang，Haigang Tan，Xi Sun，Mingyue Wu，Dongguang Xiao 期刊:Analytical Biochemistry 影響因子:2.275 PMID:23597844
 

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