大多數感染真核生物的病毒都有一個正單鏈RNA(+ssRNA)基因組。一般認為，+ssRNA病毒只在基因組正鏈RNA(+RNA)中編碼開放閱讀框架(ORF)，而病毒的負義鏈RNA(-RNA)是一種病毒復制中間體，其功能是作為后代基因組RNA生物合成的模板。病毒基因組RNA作為mRNA直接與核糖體相互作用，并被翻譯成病毒蛋白質，包括用于病毒復制的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRPs)。
植物病毒具有密集的基因組，小開放閱讀框(sORFs)是編碼長度小于100個氨基酸(aa)蛋白質的開放閱讀框；sORFs翻譯的小蛋白與不同生物體（包括植物和動物病毒）的各種生物過程有關。馬鈴薯Y病毒科目前由12個屬、237個物種組成，其中包括最大的植物感染+ssRNA病毒（馬鈴薯Y病毒）。約10kb的馬鈴薯病毒基因組由編碼大的多聚蛋白的單個ORF組成，該蛋白被蛋白水解加工成10種功能蛋白，分別為P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和衣殼蛋白質(CP)。另一種蛋白質P3N-PIPO是通過轉錄滑移合成的，這導致在一小部分RNA轉錄物的5’端附近增加了額外的A殘基。但馬鈴薯Y病毒屬是否在其RNA中編碼額外的小蛋白尚未被探索。
冠狀病毒（冠狀病毒科）是一個有包膜+ssRNA病毒的大家族。嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬。SARS-CoV-2的基因組大小約為30kb，包含14個典型的病毒開放閱讀框，50個ORF1a/ORF1ab組成了整個基因組的前三分之二，它編碼一種多聚蛋白，最終被蛋白酶切割成16種非結構蛋白(Nsp1-Nsp16)，病毒基因組3’端的最后三分之一包含13個ORF，編碼4種結構蛋白（刺狀蛋白[S]、包膜蛋白[E]、膜蛋白[M]和核衣殼蛋白[N]）和9種可能的輔助蛋白(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF9b、ORF9c和ORF10)。但SARS-CoV-2的RNA中是否編碼額外的小蛋白仍不清楚。
本文在來自不同科的幾種植物、脊椎動物和無脊椎動物+ssRNA病毒的RNA中鑒定了幾個潛在的小反向ORFs(rORFs)。通過研究蕪菁花葉病毒(TuMV)，發現這些sORFs對病毒侵染至關重要，其編碼的蛋白質具有特定的亞細胞定位，證明了rORF2蛋白是由馬鈴薯Y病毒rORFs編碼的蛋白，可與病毒復制復合體共定位以及TuMV RdRP相互作用，并作為毒力因子發揮作用。動物病毒SARS-CoV-2的rORFs(rORF1-rORF3)可能通過拮抗I型干擾素(IFN-I)介導的抗病毒先天免疫反應來促進水泡性口炎病毒(VSV)感染。另外，RNA中的TuMV-rORF可能是由病毒內部核糖體進入位點(IRES)翻譯的。因此，作者提出+ssRNA病毒在其-RNA中編碼小功能蛋白，這些蛋白可以影響病毒復制和毒力，或者可能有助于逃避宿主先天免疫反應，從而促進病毒侵染。這些發現擴展了對+ssRNA病毒所采用的編碼策略的理解，并擴大了已知的病毒蛋白質組及其與宿主細胞的潛在相互作用。
基本信息
題目：
Plant and Animal Positive-sense Single-stranded RNA Viruses Encode Small Proteins Important for Viral Infection in Their Negative-sense Strand
期刊：Molecular Plant
影響因子：27.5
PMID: 37777826
DOI: 10.1016/j.molp.2023.09.020
通訊作者：周雪平 李方方
作者單位：
中國農業科學院植物保護研究所
索萊寶合作產品：
產品貨號 | 產品名稱 |
K200015M | Anti-mCherry Tag Monoclonal Antibody |
摘 要
正單鏈RNA(+ssRNA)病毒是自然界中含量豐富的真核生物病毒，需要使用基因組+RNA作為復制模板合成-RNA。植物和動物+ssRNA病毒的RNA中含有小的開放閱讀框(ORF)（反向ORF[rORF]）。利用蕪菁花葉病毒(Tumv)作為植物+ssRNA病毒的模型，證明了rORFs編碼的小蛋白具有特定的亞細胞定位，并通過質譜分析證實rORF2在感染細胞中的存在。TuMV rORF2編碼的蛋白質形成點狀顆粒，定位于核周區域，并與病毒復制復合體共定位。RORF2蛋白可以直接與病毒RNA依賴的RNA聚合酶相互作用，rORF2的突變消除了病毒的侵染，而rORF2的異位表達拯救了突變的病毒。此外，SARS-CoV-2的RNA具有抑制I型干擾素產生和促進水泡性口炎病毒侵染的作用。作者提供了TuMV可能利用內部核糖體進入位點來翻譯這些小rORF的證據。綜上所述，這些發現表明+ssRNA病毒的-RNA也可以具有編碼能力，其中編碼的小蛋白在病毒侵染中發揮關鍵作用。
研究內容及結果
1.鑒定+ssRNA病毒RNA中的sORFs
馬鈴薯Y病毒科、南方菜豆花葉病毒科、冠狀病毒科和黃病毒科病毒的基因組序列分析發現了許多編碼超過10個氨基酸的蛋白質的ORFs，與+RNA中已知的ORFs類似，這些病毒的RNA在每個科內選定的病毒子集中具有高度代表性（圖1A–D）。由于這些ORFs是在病毒+RNA的反向互補序列中預測的，所以將它們命名為rORFs（圖1E）。
圖 1
2.TuMVrORF編碼的蛋白質具有特定的亞細胞定位，可被招募到病毒復制復合體(VRC)
在TuMV中鑒定出幾個小rORFs、rORF1-rORF4，并發現在馬鈴薯Y病毒科中有大量匹配（圖1A和2A）。TuMV-rORF1–rORF3編碼的蛋白質與黃色熒光蛋白(YFP)融合，定位于細胞核、核周區域和細胞質，而rORF4僅限于核周區域（圖2B）。TuMV rORF1-YFP定位在葉綠體周圍，并與過氧化物酶體標記DsRed-SKL共定位，但不與高爾基體標記共定位（圖2C），與葉綠素自發熒光和ER標記mCherry-HDEL（his-asp-glu-leu在其N末端融合mCherry蛋白）的共定位發現TuMVrORF3-YFP在葉綠體和內質網(ER)中（圖2D）。馬鈴薯Y病毒科復制發生在細胞質膜結合的VRC中，在細胞核附近可以看到密集的塊狀物。使用表達青色熒光蛋白(CFP)標記的病毒RdRP(NIb)和mCherry標記的葉綠體定位膜蛋白(6K2)的TuMV-6K2-mCherry-CFP-NIb感染性克?。▓D2E），可以發現這些rORF編碼的蛋白質在病毒侵染過程中被招募到VRC中復制（圖2F）。四種新蛋白均與6K2誘導的TuMVVRC和dsRNA共定位，這些rORF在病毒復制過程中VRC的形成和活性中具有潛在作用（圖2G-H）。
圖 2
3.TuMV rORF2編碼蛋白是病毒感染所需的毒性因子
所有突變病毒在接種后60h時均呈現出明顯較少的RNA和蛋白質積累（圖3A-C）。接種后5d和12d，TuMV-GFP-mrORF2未能在接種植物的全身組織中檢測到病毒RNA和CP；rORF1、rORF3或rORF4的突變對TuMV癥狀和病毒積累的影響較輕微（圖3D-H）。
除P3NPIPO外，rORF2蛋白與已報道的TuMV蛋白同時被檢測到（圖4A-B）。PVX-rORF2在28d時表現出嚴重的癥狀（圖4C）。此外，PVX載體表達的rORF2基因可以彌補接種TuMV-GFPmrORF2突變體的本氏煙草中rORF2的缺失（圖4D-F）。RORF2-YFP的轉基因表達恢復了TuMV-mrORF2-GFP的感染（圖4G-I）。
rORF2和11種典型TuMV蛋白酵母雙雜交(Y2H)測定發現rORF2編碼的蛋白質與酵母細胞中的NIb相互作用（圖4J）。紅色熒光蛋白(RFP)-H2B轉基因本氏煙草植物葉子的雙分子熒光互補(BiFC)，證實體內相互作用發生在植物細胞的細胞質中（圖4K）。NIb與TuMV感染細胞VRC中的rORF2相互作用（圖2F和4K），進一步表明rORF2參與TuMV復制。
圖 3
圖 4
4.SARS-CoV-2rORF的特征
使用SARS-CoV-2作為模型（圖5A）推測由rORFs編碼的蛋白質尺寸較小(<10kDa)，rORFs在SARS-CoV-2相關變體(VOC)中也保守（圖5B）。rORF3編碼的蛋白質預計包含兩個跨膜結構域（圖5C）。SARS-CoV-2 rORF編碼蛋白的GFP標記，三種融合GFP的rORF編碼蛋白均積累到相當的水平，但在HEK293T細胞中出現不同的亞細胞定位。GFP-rORF1分布在細胞核和細胞質中，GFP-rORF2主要位于細胞核中，GFPrORF3主要分布在細胞質中（圖5D-E）。
圖 5
5.SARS-CoV-2rORF編碼蛋白是IFN-I拮抗劑
標記SARS-CoV-2的rORF1-3可以降低維甲酸誘導基因IRIG-IN誘導的干擾素β啟動子活性（圖6A）。SARS-CoV-2 rORF2和ORF6可明顯抑制外源干擾素-α誘導的ISRE啟動子的活性（圖6B）。
圖 6
6.SARS-CoV-2rORF編碼蛋白抑制SG的形成并促進病毒侵染
與表達GFP的細胞相比，表達N-FLAG的細胞中每個細胞可檢測的SG面積顯著減少，并且N蛋白與SG中的G3BP1共定位，表達rORF1-GFP和rORF3-GFP的細胞中SG形成顯著減少（圖6C和6D），表明rORF1和rORF3介導對SG形成的抑制。GFP-rORF1和G3BP1也共定位于NaAsO2處理細胞中的剩余SG（圖6C），表明rORF1可能通過與G3BP1相互作用隔離G3BP1來減弱SG形成。表達單個SARS-CoV-2rORF的細胞中VSV-GFP侵染的效率顯著高于對照細胞（圖6E-F）。
7.小TuMV rORF可能由病毒IRES翻譯
作者設計了一個雙順反子系統（圖7A）。通過農桿菌介導法將含有TuMV rORFs上游序列的雙順反子載體瞬時地表達到本氏煙草的葉片組織中（圖7B）。mCherry積累的差異不是由于mRNA水平的變化所致（圖7C）。用β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的序列取代驅動GFP-mCherry轉錄的35S啟動子（圖7D）。蛋白質印跡分析表明無啟動子載體無法在本氏煙草葉子中表達GFP或mCherry（圖7E）。qRT-PCR分析表明35S啟動子驅動的表達mRNA產物在植物細胞中具有特異性條帶，表明不存在隱性剪接位點（圖7F）。
圖 7
結 論
使用兩種不相關的+ssRNA病毒感染不同來源的生物體，實驗證明了+ssRNA病毒的RNA在病毒侵染過程中編碼具有生物學作用的小蛋白。該研究需重新考慮之前的假設，即該鏈缺乏生物相關的蛋白質編碼信息，如植物TuMV所示，需要重新研究已知的+ssRNA-vi病毒的蛋白質組，并且可能會擴大。
索萊寶產品亮點
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產品貨號 | 產品名稱 |
P08119 | Recombinant mCherry Tag protein |
VT001104 | pBV220-mCherry |
VT000009 | pET28a-mCherry |
K200047M | Anti-GFP Tag Monoclonal Antibody |
K009323P | Anti-GFP-Tag Polyclonal Antibody |
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